近日，European Heart Journal在线发表题为“Endothelial cell-derived tetrahydrobiopterin prevents aortic valve calcification Get access Arrow”的研究论文，浙江大学蔡哲钧及华中科技大学李飞为共同通讯作者。
近日，European Heart Journal在线发表题为“Endothelial cell-derived tetrahydrobiopterin prevents aortic valve calcification Get access Arrow”的研究论文，浙江大学蔡哲钧及华中科技大学李飞为共同通讯作者。
钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）是发达国家常见的心血管疾病。其特点是瓣叶进行性纤维钙化重塑。主动脉瓣由瓣膜间质细胞（VIC）和瓣膜内皮细胞（VEC）组成。VICs遍布整个主动脉瓣，而VECs位于外层并保持非血栓形成表面。大多数先前的研究都集中在VICs上，只有少数研究探讨了VECs和VICs在主动脉瓣钙化中的相互作用。
瓣膜内皮细胞衍生的一氧化氮（NO）是瓣膜钙化早期阶段的天然抑制剂，也是瓣膜稳态和病理的重要调节剂。在兔模型中，内皮一氧化氮合酶（eNOS）在慢性高胆固醇血症期间下调，由此导致的亚硝酸盐生成增加促进了主动脉瓣钙化的发展。相比正常小鼠，eNOS缺陷小鼠中二尖瓣主动脉瓣的患病率更高。在培养的猪VIC中，NO抑制钙化结节的形成。在3D共培养系统中，猪VEC NO水平的降低会增加成骨分化和基质钙化的风险。因此，eNOS功能障碍在主动脉瓣钙化的发展中起重要作用。
四氢生物蝶呤（BH4）是eNOS生物学功能的关键决定因素，通过改变eNOS的偶联状态，在调节内皮功能中发挥双重作用。BH4可以在补救途径中以NAD(P)H为代价，从5'-三磷酸鸟苷（GTP）或二氢生物蝶呤（BH2）从头合成。因此，鸟苷5'-三磷酸环水解酶I（GCH1）和二氢叶酸还原酶（DHFR）是两种关键酶。
BH4与eNOS结合，使其保持偶联二聚体状态，从而产生NO。然而，由于BH4缺乏，解偶联的eNOS会产生超氧化物而不是NO。超氧化物与NO反应形成过氧亚硝酸盐（ONOO-），进一步降低NO的生物利用度（图1）。越来越多的证据表明，BH4不足依赖性eNOS解偶联介导内皮功能障碍，并导致血管疾病（如高血压和动脉粥样硬化）。然而，迄今为止尚未探索BH4在主动脉瓣钙化中的作用。因此，本研究旨在探讨VEC衍生的BH4在主动脉瓣钙化中的作用。
图1.内皮细胞来源的四氢生物蝶呤在主动脉瓣钙化过程中的推测作用机制
CAVD患者血浆和主动脉瓣中BH4水平和BH4：BH2比值降低
首先评估对照组和CAVD患者血浆中BH4和BH2的浓度。发现CAVD患者的血浆BH4：BH2比值明显低于对照组(图1C）。进一步测定主动脉瓣组织中BH4和BH2的水平，CAVD患者主动脉瓣中的BH4浓度和BH4：BH2比值明显低于正常主动脉瓣(图2D-F）。多变量线性回归模型显示，CAVD仍然是影响血浆或主动脉瓣BH2、BH4水平和BH4：BH2比值的唯一因素。
图2
内皮细胞特异性缺陷Gch1促进主动脉瓣钙化
与正常主动脉瓣相比，钙化主动脉瓣中BH4生物合成的两种关键酶，鸟苷5'-三磷酸环水解酶 I (GCH1）和二氢叶酸还原酶（DHFR）显著减少。BH4缺乏可导致eNOS解偶联，进一步导致过氧亚硝酸盐形成增加。据报道，内皮特异性Gch1(Gch1fl/flTie2Cre）缺陷抑制了BH4的生物合成，导致eNOS解偶联和内皮功能障碍。研究人员生成内皮细胞特异性缺陷（Apoe-/-Gch1fl/flTie2Cre）小鼠，以及Apoe-/-Gch1fl/fl同窝小鼠，并西方饮食（WD）喂食24周，以建立主动脉瓣钙化模型。
在4周的西方饮食（WD）作用后，与Apoe-/-Gch1fl/fl小鼠相比，Apoe-/-中Gch1的内皮细胞特异性缺陷小鼠的主动脉瓣叶中的跨瓣峰值射流速度、钙沉积、Runx2、dihydroethidium（DHE）和3-硝基酪氨酸 (3-NT) 水平明显增加。
氧化的LDL（ox-LdL）与si-GCH1或si-DHFR转染的VEC共培养诱导瓣膜间质细胞（VIC）的成骨细胞分化，而补充BH4可以消除这种影响。VECs中BH4的缺乏导致VICs在ox-LdL刺激下过氧亚硝酸盐形成增加和3-NT蛋白增加。
叶酸通过增加DHFR抑制VIC成骨细胞分化
BH4在主动脉瓣钙化中起关键作用。补充BH4是否能缓解体内主动脉瓣钙化？由于BH4的不稳定性，研究使用了叶酸（FA），通过挽救BH4来改善内皮细胞的DHFR功能，改善eNOS的重建偶联。FA对VECs和VEC/VIC共培养模型的影响显示，FA显著增加了VECs中DHFR的表达(图3A和B）。与预期的一样，FA显著降低了ox-LdL诱导的VICs的碱性磷酸酶（ALP）和Runx2的表达(图3C-E）。然而，当VICs与沉默DHFR的VECs共培养时，FA的作用减弱(图3F-H）。FA在不与VECs共培养的情况下，发现FA不能阻止ox-LdL诱导的VICs的成骨分化。FA通过增加DHFR和挽救BH4生物合成，显著减弱WD喂养的Apoe-/-小鼠的主动脉瓣钙化。
图3
叶酸或能防主动脉瓣钙化
过去的十年间，我们对主动脉瓣钙化相关机制的认识不断深入，潜在的新靶点有助于探索CAVD患者的有效治疗。本研究有几个局限性。首先使用Tie2Cre作为工具来创建内皮特异性缺乏模型。虽然Tie2在巨噬细胞中几乎不表达，但最近的一项研究报道，使用Tie2Cre可能敲除小鼠骨髓源性巨噬细胞中的Gch1，由于iNOS激活减少而抑制炎症反应。为了充分解决这个问题，可能需要骨髓移植来排除巨噬细胞的可能的影响。其次，WD喂养的Apoe-/-小鼠模型也存在局限性，可能不能完全模拟人CAVD的完整进展。最后，研究还缺乏关于补充FA对CAVD患者影响的数据，有必要通过长期随访的大型队列研究来证明FA对CAVD的潜在获益。
综上所述，该研究发现内皮依赖性BH4水平的降低促进了过氧亚硝酸盐的形成，进而导致DRP1酪氨酸硝化和VIC的成骨细胞分化，从而导致主动脉瓣钙化。补充FA可以通过挽救BH4的生物利用度来减轻高胆固醇血症引起的小鼠主动脉瓣钙化。FA可能是一种经济有效的预防CAVD的策略。
参考：
Zongtao Liu， Nianguo Dong， Haipeng Hui， et al. Endothelial cell-derived tetrahydrobiopterin prevents aortic valve calcification. European Heart Journal， 09 February 2022
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